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线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）表达的改变发生于衰老和一系列人类疾病中，例如神经退行性疾病和癌症等。肿瘤细胞的生长和具有治疗抵抗性的肿瘤干细胞的持续存在依赖于氧化磷酸化（oxidativephosphorylation,OXPHOS）系统，而线粒体RNA聚合酶（mitochondrialRNApolymerase,POLRMT）对于OXPHOS的系统发生具有至关重要的作用。因此，靶向POLRMT开发特异性抑制剂不失为一种治疗相关疾病的强力工具。
近日，来自德国马克斯·普朗克衰老生物学研究所的Nils-G?ranLarsson课题组和来自瑞典哥德堡大学的ClaesM.Gustafsson课题组合作在Nature杂志上发表了一篇题为Small-moleculeinhibitorsofhumanmitochondrialDNAtranscription的文章，该团队首创（First-in-Class）靶向人类POLRMT的线粒体转录特异性抑制剂（inhibitorsofmitochondrialtranscription,IMTs），IMTs能够有效破坏重组系统中的mtDNA转录，并对细胞株中的mtDNA表达和OXPHOS产生剂量依赖性的抑制。重要的是，IMT口服四周治疗在人类癌细胞异种移植中可以诱导强烈的抗肿瘤反应，但并不会导致OXPHOS功能障碍或对正常组织产生*性。因此，IMTs为研究mtDNA在生理和疾病中的作用提供了一项强有力且特异的化生工具。
作者设计并开发出IMT1和IMT1B两种化合物，以非竞争性抑制的方式引起POLRMT发生构象改变，从而在体外以剂量依赖的方式阻断底物的结合和转录以及mtDNA的逐渐耗竭。那么，这两种抑制剂是否特异性的针对人类POLRMT发挥作用呢？作者通过单核苷酸掺入分析，发现IMT1B并未抑制萌芽酵母线粒体RNA聚合酶（RPO41），噬菌体T7RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶等，此外，在体外也并未能抑制人类RNAPolII，对细胞系中依赖于RNAPolI、II和III的转录水平也没有影响。与此同时，作者使用IMT结构相关类似物作为独立对照，结果显示其既不结合POLRMT也不影响mtDNA的表达，证实这两种抑制剂的高度特异性。
那么IMTs如何作用于POLRMT呢？作者在A细胞中进行无偏见的全基因组正向遗传筛选，将细胞暴露于诱变剂中，并用野生型致死剂量的IMT1类似物处理，对表现出耐药性的克隆进行外显子组测序，共筛选出六个POLRMT点突变且聚集在POLTMT蛋白的同一结构域。紧接着，作者通过在A细胞中过表达重组的野生型和突变型POLRMT并加以IMT1处理，结果只有突变型细胞表现出抗药性，提示POLRMT是IMT1的体内靶点。进一步地，作者使用冷冻电镜鉴定出IMT1B存在下的POLRMT蛋白结构，证实了IMT1B作为POLRMT的变构抑制剂，在空间上削弱DNA-RNA杂交的结合以及新生RNA的易位。
图1.冷冻电镜显示IMT1B存在下的POLRMT蛋白结构以及IMT1B变构抑制POLRMT活性示意图接下来，作者进行了一项大规模的细胞活性测定，涉及89种癌细胞系和原代细胞，经IMT1处理后，约有三分之一的癌细胞系存活率显着下降而原代细胞则无反应，且对IMT1的敏感性与肿瘤细胞系的组织来源没有任何明显的相关性。重要的是，IMT1处理对人PBMCs或原代人肝细胞没有细胞*性，这表明IMTs可能具备在体内治疗肿瘤的潜力。
那么IMTs如何影响肿瘤细胞的存活率呢？作者通过对IMT1处理的A细胞中的代谢物分析显示，这些细胞中存在严重的“能量危机”。线粒体除了产生ATP之外，还能为核苷酸和氨基酸的生成提供多种代谢中间产物，在用IMTs处理细胞48h后，dATP水平下降到对照值的55%，尤其是在h后仅下降到对照组的13%，dCTP和dTT以及柠檬酸循环中间产物也是类似变化模式。因此，用IMT1治疗会使细胞处于严重的能量和营养缺乏状态，必要的细胞成分丢失无法补偿从而引起细胞增殖减少，死亡总数增加。
图2.IMTs能够特异性抑制癌细胞的增殖
随后，作者想知道IMTs在体内是否具有与体外测试同样的效力。作者对含有人A或DLD-1癌细胞异种移植物的小鼠进行口服IMT1B处理。根据差示扫描荧光法和体外转录分析结果，小鼠POLRMT对IMT1B治疗的敏感性与人类相似。在用IMT1B治疗野生型小鼠4周后，也并未观察到急性或慢性肝或肾*性，以及贫血，血小板减少或白细胞减少症的迹象。在分子水平上，用IMT1B治疗的小鼠肿瘤中的mtDNA转录水平和呼吸链亚单位水平均降低。需要注意的是，先前用IMTs处理Hela细胞可以引起mtDNA耗竭，而在异种移植肿瘤中却未观察到这一现象，加之先前研究也表明有丝分裂后的组织可以长时间耐受mtDNA的缺失，这些现象提示了mtDNA对于快速分裂细胞OXPHOS系统生物发生的重要性，也解释了IMTs对mtDNA表达的阻断可以在不影响正常组织的情况下具备显著的抗肿瘤作用。
总的来说，IMTs是POLRMT的首创有效且高度特异的变构抑制剂，对于mtDNA转录功能而言至关重要。IMTs在临床前小鼠模型中显示出治疗癌症的有效性，并有可能进一步开发并用于人类癌症的临床应用。此外，IMTs也是一种强力的化学生物学工具，能够操纵mtDNA转录，从而在动物模型中以剂量依赖的方式来评估OXPHOS的下调如何影响与人类健康相关的各种生理和疾病过程。
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