北京那个医院治疗白癜风啊 http://m.39.net/pf/bdfyy/bjzkbdfyy/摘要
目的
采用代谢组学技术，筛选可以用于预测曲妥珠单抗辅助治疗人类表皮生长因子受体-2（HER-2）阳性乳腺癌疗效的生物标志物。
方法
收集年1月至年12医院治疗的乳腺癌患者60例的血清样本，分为化疗组（30例）和化疗+曲妥珠单抗治疗组（30例），分别采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-OrbitrapHRMS）技术和SIMCA14.1软件中的多元变量模式对样本及数据进行检测和分析。
结果
两组代谢物构建的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型稳健性良好，以P0.05且VIP1.0为筛选条件，筛选并鉴定出8个差异代谢物，可用于预测曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性乳腺癌的疗效。
结论
代谢组学技术可揭示化疗+曲妥珠单抗组治疗HER-2阳性乳腺癌血清中内源性代谢物的变化特点，筛选出的生物标志物可用于疗效预测，同时为研究曲妥珠单抗的疗效评价提供新思路。
乳腺癌为威胁女性健康和生存的头号杀手，每年全世界有近万起的乳腺癌新增病例及超过45万起的死亡病例发生［1,2,3］。大约有1/3左右的乳腺癌患者人类表皮生长因子受体-2（HER-2）呈过表达状态，这部分患者预后较差［4,5,6,7］。
曲妥珠单抗人源化单克隆抗体，美国食品药品监督管理局年批准用于HER-2阳性乳腺癌的一线治疗抗体。有研究表明，曲妥珠单抗联合化疗，可降低40%的HER-2阳性乳腺癌患者复发风险和37%的死亡风险［8,9,10］。本研究以代谢组学理论为基础，采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-OrbitrapHRMS）技术，动态检测曲妥珠单抗联合化疗方案与化疗方案的HER-2阳性乳腺癌患者血清代谢物变化，从代谢组学角度阐明HER-2阳性乳腺癌患者血清代谢产物的变化特点，筛选用于预测曲妥珠单抗辅助治疗疗效的生物标志物，从而为曲妥珠单抗的疗效评价提供新思路。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
Ultimate超高效液相色谱系统（Dionex公司，美国）串联Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（ThermoFisherScientific公司，美国），HeraeusFresco17离心机（ThermoFisherScientific公司，美国），涡旋仪VORTEX-GENIE（ScientificIndustries），十万分之一分析天平（ThermoFisherScientific公司，美国）；2-氯-L-苯丙氨酸标准品购自JKChemical（中国北京），酮洛芬标准品购买自SigmaAldrich公司，甲醇、乙腈（HPLC级），ThermoFisher公司，甲酸（HPLC级），SigmaAldrich公司。
1.2研究对象
收集年1月至年12医院乳腺外科治疗的乳腺癌患者60例，按照随机数字表法分为化疗组（H组，30例）和化疗+曲妥珠单抗（罗氏制药生产，国药准字J）治疗组（Q组，30例）。在选取两组病例时参照以下标准：（1）符合乳腺癌诊断标准且经病理检查确诊，均为初发患者且尚未接受治疗。（2）无代谢性疾病和长期服药史。（3）无其他疾病。（4）两组患者在年龄等方面相匹配。由于代谢产物易受多种因素影响，如并发症、患者饮食习惯及药物使用情况等，特制定以下纳入标准：（1）手术前通过活检病理确定HER-2阳性。（2）化疗方案相同。（3）无其他疾病。（4）未参加其他药物临床试验。所有入选患者均签署书面知情同意书，本研究符合版《世界医学协会赫尔辛基宣言》的要求。
1.3方法
1.3.1样本预处理
年1月至年12月收集符合纳入标准的患者的血清置于-80℃保存。取解冻后的血清样本μL，冰上操作，加入μL含内标（酮洛芬ng/mL，2-氯-L-苯丙氨酸50ng/mL）甲醇溶液，涡旋震荡5min，离心（1rpm，10min）；取上清液于自动进样小瓶待测。同时每例血清样本各取30μL合并制成质控样本（QC），以相同方法处理。
1.3.2色谱及质谱条件
色谱条件：采用ACQUITYUPLCBEHC18column（mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA）进行色谱分离，色谱柱柱温为40°C，流速为0.3mL/min，其中A流动相为水和0.1%甲酸，B流动相为乙腈。对代谢物采用以下梯度进行洗脱：0~1.0min，5%B；1.0~9.0min，5%~%B；9.0~12.0min，%B；12.0~15.0min，5%B。每个样本的上样体积为5μL。
质谱方法：离子源为HESI（heatedESI）源，离子传输管温度为℃，辅助气温度为℃，辅助气流速为10μL/min；正离子模式下：鞘气流速为40μL/min，喷雾电压为3.50kV；负离子模式下：鞘气流速为38μL/min，喷雾电压为2.80kV，m/z扫描范围为80~，一级扫描分辨率为。
1.3.3系统稳定性检测
为保证实验结果的可靠性，本研究采用在序列中穿插QC样本来对数据的采集进行监控，在运行序列中首先使用6个QC样本平衡仪器（监测每次进样前后的压力变化以及TIC图的主要峰保留时间的偏移），之后每5个检测样本穿插一个QC样本。
1.3.4数据处理和统计学方法
将UHPLC-Q-OrbitrapHRMS平台分析得到的数据导入CompoundDiscoverer3.0（ThermoFisherScientific，CD）软件进行峰提取、峰对齐、峰校正、标准化等数据前处理。最终得到一个由样本名称、谱峰信息（包括保留时间和分子质量）、及峰面积组成的三维数据表，使用Excel利用QC样本对所有峰进行总面积归一化，将总面积归一化后的数据导入SIMCA（version14.1，Umetrics，Sweden）中进行一系列的多元变量模式识别分析。构建主成分分析（PCA）模型并绘制PCA得分图，直观的表示组与组之间的差异；构建正交偏最小二乘方判别分析（OPLS-DA）模型并计算代谢产物的在投射中不同的重要性（VIP）值；通过MetaboAnalyst在线分析平台计算代谢产物的P值和Foldchange值。以VIP值1、P值0.05为筛选条件筛选差异代谢物，以精确的质荷比（m/z）、一级色谱峰和二级质谱图进行确认，将找到的差异代谢物在HMDB（HumanMetabolomeDatabase）数据库中进行检索，确认是内源性代谢物。
2结果
2.1原始数据预处理
对两组血清样本在“1.3.2”项色谱及质谱条件下采集总质子流图（TIC图）。将得到的质谱数据导入CD中，在正离子模式下共提取到个离子峰，在负离子模式下共提取到个离子峰，将得到的数据进行统计分析。
2.2多元变量统计分析
PCA能从整体上反映各组之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，SIMCA软件可进行自动化模型拟合分析，获得最可靠数学模型的主成分数目并绘制PCA得分图。对本研究的血清样本进行PCA分析后结果见图1，由PCA得分图可以看出，QC样本聚集性较好，反映出本研究采用的仪器和方法具有良好的稳定性和重复性。样本大部分处于95%置信区间，仅有个别不在范围内，这是由于临床样本的个体化差异造成的异常样本；正、负离子模式下样本组间差异明显。为其构建OPLS-DA模型，结果显示两组样本得到了很好地区分；为检验模型的重复性是否良好、确保模型的可靠性及模型是否存在过拟合的现象，对模型进行置换检验，结果显示该模型具有较好的拟合性和预测性，见图2。
图1
化疗+曲妥珠单抗治疗组(Q)与化疗组(H)的主成分分析（PCA）得分图
图2：化疗+曲妥珠单抗治疗组(Q)与化疗组(H)的偏最小二乘回归分析（OPLS-DA）得分图（A,C）及置换检验图（B,D）
2.3潜在生物标志物的筛选和鉴定
为避免只使用一类统计分析方法带来的假阳性错误或模型过拟合现象，本研究结合单变量统计分析同时考量两类统计方法的结果。本研究使用T检验进行组间差异分析，同时结合OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（VariableImportanceintheProjection，VIP）参数，从而筛选潜在的生物标志物。基于单变量统计分析对差异代谢物筛选的结果以火山图（volcanoplot）的形式进行可视化，结果见图3。火山图中每个点代表一个代谢物，横坐标代表该组对比各物质的倍数变化（取以2为底的对数，即Log2Foldchange），纵坐标表示T检验的P-value（取以10为底的对数的负值，即-Log10P-value），灰色点为P0.05的代谢物（无统计学意义），蓝色点为P0.05且Log2Foldchange为负数的代谢物表示在Q组中显著下调的代谢物，红色点为P0.05且Log2Foldchange为正数的代谢物表示在Q组中显著上调的代谢物。
图3：化疗+曲妥珠单抗治疗组与化疗组组的差异代谢物火山图
以P0.05且VIP1.0为筛选条件，筛选得到的Q组和H组的差异代谢物经鉴定后，通过HMDB在线数据库检索确认为内源性成分，结果见表1。
表1：化疗+曲妥珠单抗治疗组与化疗组的差异代谢物
3讨论
代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后的一种新兴组学技术，主要研究生物体系在生理或病理状态下内源性代谢产物的变化规律及差异。代谢产物是生命活动链的终点，反映的是各种生命活动所产生效应的最终表现。发现病理状态下的代谢标志物，建立代谢谱可用于疾病的早期诊断，指导临床用药和治疗。目前，代谢组学技术已被广泛应用于疾病诊断、药物作用机制研究、新药开发等多个领域［11,12］。
LC-MS/MS技术平台被广泛应用于代谢疾病的早期诊断。该技术结合了色谱的高分离性能和质谱强大的鉴别能力，具有高灵敏度、高特异性、高通量等优势，是代谢组学常用的分析手段之一［1，3］。目前乳腺癌患者化疗疗效评估主要依靠影像学，用影像学判断治疗效果时间长，且会对患者造成二次伤害［13］。研究表明氨基酸代谢水平的变化对乳腺癌晚期患者的化疗疗效有一定的预测价值，有助于优化治疗策略且无任何副作用［13］。
研究表明，化疗后肿瘤自身及肿瘤微环境中的氨基酸代谢水平变化可能比肿瘤体积变化更早［14］，因此肿瘤微环境中的氨基酸代谢水平变化可反映肿瘤组织的变化。体内氨基酸水平的变化受多方面因素的影响，利用代谢组学技术筛选出的差异性代谢物可消除多种因素带来的个体差异，结果更加可靠。本研究筛选出的差异代谢产物均为氨基酸，其中谷氨酸和天门冬氨酸的显著上调的结果与Jové等［15］的研究结果健康人群的谷氨酸和天冬氨酸含量水平显著高于乳腺癌患者的含量水平相一致，表明化疗+曲妥珠单抗组的疗效要优于化疗组的疗效，这两个代谢指标可用来预测曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性乳腺癌的疗效。本研究还对所有受试者进行3年随访，化疗+曲妥珠单抗治疗组的患者复发率明显低于化疗组，表明曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性乳腺癌的疗效较好。
综上所述，本研究初步结果表明，筛选鉴定出的内源性差异代谢物具有一定的预测性，尤其是谷氨酸和天冬氨酸，可较影像学更早更安全的评估曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性乳腺癌的疗效，可作为生物标志物进行检测，用于曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性乳腺癌的预后评估。本研究尚存在一定的局限性，病例数较少且不是多中心，不能整体反映曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性乳腺癌的疗效。因此，本研究还需要多中心的大样本进一步验证。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）本文来源：许维东,姚慧韬,张新平,等.基于超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术的曲妥珠单抗辅助治疗人类表皮生长因子受体-2阳性乳腺癌血清代谢组学研究[J].中国基层医药,,28(2):-.DOI:10./cma.j.issn.8-..02..
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